人高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞熒光素酶標記

MHCC-97H+luc

細胞介紹

來源于中山醫(yī)院，用人肝癌細胞株MHCC97-H接種裸鼠，進行3次肺轉(zhuǎn)移篩選，取肺轉(zhuǎn)移瘤建成皮下接種后高度自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的肝癌細胞系。

該細胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶Luc基因。

細胞特性

1） 來源：肝癌

2） 形態(tài)：上皮細胞樣  貼壁生長

3） 含量：>1x10^6  細胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

細胞篩選

該細胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Luc的細胞，隨細胞傳代次數(shù)的增加，其Luc熒光強度會逐漸減弱。若實驗要求需要維持熒光強度，可以加入嘌呤霉素進行再次篩選。        

建議收到細胞后至少傳3代，凍存留種后再進行篩選。

初次進行細胞篩選時，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的wan全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，若無細胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的wan全培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，以此類推，至最高藥物濃度為5ug/ml。若篩選過程中，漂浮細胞大于60%，則停止篩選，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細胞密度約80%，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進行篩選。當加入5ug/ml嘌呤霉素時細胞正常增殖，可停止篩選，用不含藥wan全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

產(chǎn)品的運輸和保存

視天氣狀況和運輸距離遠近，公司與客戶協(xié)商后選擇下述方式中的一種進行。

1) 1mL凍存細胞懸液裝于1.8ml的凍存管中，置于裝滿干冰的泡沫保溫盒中進行運輸；收到細胞后請盡快解凍復蘇細胞進行培養(yǎng)，如無法立刻進行復蘇操作，凍存細胞可在-80℃的條件下保存1個月。

2) T-25培養(yǎng)瓶充滿wan全培養(yǎng)基后進行常溫運輸；收到細胞后請鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，如鋪瓶率超過85%請立即進行傳代操作，如懸浮的細胞較多，請將培養(yǎng)瓶至于培養(yǎng)箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細胞能夠再次貼壁。

產(chǎn)品使用

1) 本產(chǎn)品僅能用于科研

2) 本產(chǎn)品未通過直接用于活體動物和人的審核

3) 本產(chǎn)品未通過用于活體診斷的審核

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01 什么是細胞永生化？

   正常組織來源的細胞在體外培養(yǎng)條件下可分裂生長，但經(jīng)過有限次數(shù)的傳代后，就會停止增殖，發(fā)生衰老和死亡，這種現(xiàn)象稱之為海夫利克極限。有的細胞自發(fā)或受外界因素的影響，可以從增殖衰老危機中逃離，從而擁有無限增殖的能力，該過程稱之為細胞永生化（cell immortalization）。

   細胞永生化是癌變的必經(jīng)途徑。

02 細胞永生化的方法？

   細胞自發(fā)永生化的幾率非常小，于人類細胞就更為罕見。

   人為干涉讓細胞永生化的方法包括：放射處理、端粒酶激活、病毒基因轉(zhuǎn)染、原癌基因激活、抑癌基因抑制等。其中，聽過慢病毒感染使細胞過表達猴腎病毒SV40 T抗原或人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT基因，是常用的兩種細胞永生化的方法。

01端粒酶激活

   端粒酶是一種能延長端粒末端的核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成。端粒酶能以自身的RNA為模板，從端粒DNA3’-OH 末端延伸端?；蚝铣尚碌亩肆NA， 以補償細胞分裂時染色體末端的縮短，從而維持端粒的長度，使細胞不會因端粒耗盡而出現(xiàn)凋亡。

   正常情況下，大多數(shù)體細胞端粒酶的表達是嚴格調(diào)控的，表達是瞬時和低水平的。在原代培養(yǎng)的細胞中穩(wěn)定表達人端粒酶催化亞基(hTERT)基因能穩(wěn)定端粒的長度，使細胞易于永生化，因此hTERT的激活是細胞永生化的重要步驟。

   雖然激活端粒酶活性能夠使多種人和動物的細胞永生化，但是對于有些細胞，重建端粒酶活性并不足以使細胞永生化，還需要借助癌基因法。

02癌基因法

   一些原癌基因，如Myc, c-Jun, c-Ias, vsrc和Mdm2，通過基因轉(zhuǎn)染可介導目的細胞永生化。c-Myc是最早被發(fā)現(xiàn)的原癌基因，有許多與瘤化相關(guān)的功能區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄表達的蛋白通過核膜進入細胞核與端粒酶的啟動子結(jié)合位點特異性結(jié)合，誘導端粒酶mRNA快速表達，直接激活端粒酶活性，促進細胞進入永生化。

   細胞永生化過程中，抑癌基因如p53, pRb, BRCA1, DPC4等，通過等位基因隱性作用、抑癌基因的顯性負作用等逐漸失去活性，細胞老化途徑受阻。實驗證明端粒酶的活性與抑癌基因表達產(chǎn)物的下調(diào)有相關(guān)關(guān)系，推測抑癌基因的失活協(xié)同端粒酶的激活共同參與細胞永生化進程。

03病毒基因轉(zhuǎn)染

很多病毒感染能夠誘導細胞永生化，例如EB病毒(epstein-barr virus, EBV)、猿猴病毒40 (simian virus40, SV40)和人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)。這些病毒感染其天然宿主細胞，能誘導細胞永生化。

   EBV能使B淋巴母細胞永生化形成淋巴母細胞樣細胞系，它是通過潛伏蛋白激活細胞因子與其受體相互作用的途徑使細胞永生的。EBV永生化B細胞的一個顯著的特點是端粒酶活性的提高，這可能是導致B細胞永生的主要原因。目前，EB病毒介導的細胞永生化應用最多的是B淋巴細胞，其他細胞中的應用很少。

   SV40是簡單的真核細胞病毒，SV40的T抗原片段是常用的目的片段，將其整合入靶細胞核內(nèi)并表達，可導致細胞增殖活力的改變并表現(xiàn)出多種與腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)化顯型。應用的方法包括：野生型SV40病毒共培養(yǎng)感染靶細胞、磷酸鈣法、電穿孔以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法等。

   HPV已成功將人的包皮細胞、角化上皮以及乳腺、胰導管和口腔等的上皮細胞永生化。HPV病毒的早期表達蛋白E6和E7在細胞永生化中起決定性作用。E6和E7蛋白能夠改變細胞的終末分化，誘導細胞進入S期，使細胞繞過正常細胞的周期檢查點。

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