豬鼻甲黏膜成纖維細胞 PT-K75 

DMEM+10%FBS+1%P/S 

貼壁生長

細胞培養(yǎng)基本知識

體內(nèi)組織細胞在體外培養(yǎng)時，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似，但由于物種、個體遺傳背 景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養(yǎng)技術措施 亦不盡相同，現(xiàn)介紹個別組織細胞培養(yǎng)的要點如下：

上皮細胞培養(yǎng)

視網(wǎng)膜色素上皮細胞

上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細胞培養(yǎng)中?；祀s有成纖維細胞，培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)關鍵。體內(nèi)上皮細胞生長在膠原構成的基膜， 因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長， 另外人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以 3T3 細胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低 PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。以表皮細胞為例， 用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細胞， 其法如下：

1、 取材：外科植皮或手術殘余皮膚小塊， 早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好， 取角化層薄者， 切成 0.5－1 平方厘米小塊。

2、置 0.02%EDTA 中，室溫，5 分鐘。

3、換入 0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。

4、分離：取出皮塊，用血管或鑷子將表皮與真皮層分開。

5、取出表皮，剪成更小的塊后，置 0.25%胰酶中，37℃，30—60 分鐘。

6、反復吹打，制成懸液。

7、培養(yǎng)：用 80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。

8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle 加 20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2 溫箱培養(yǎng)。

內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

人腦微血管內(nèi)皮細胞

內(nèi)皮細胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細胞，對于研究內(nèi)皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。研究人內(nèi)皮細胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便，其法如下：

1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌剪取 10—15 厘米長一段，如不能立即培養(yǎng)，可于 12 小 時內(nèi)保存于 4℃。

2、用三通注射器吸取溫 PBS 液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊， 以防液體返流。

3、用血管緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為 0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化 3—10 分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

4、吸出含有內(nèi)皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫 PBS 輕輕反復沖洗后，一 并注入離心管中（此步驟可重復） 。

5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫 箱培養(yǎng)。兩至三天可見細胞長成單層。

神經(jīng)細胞培養(yǎng)

神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細胞

神經(jīng)細胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細胞因子時，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象， 但很難使之增殖。而神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長的膠質(zhì)細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用 ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉化。

一．設備：無菌操作設備。

二．大型設備

CO2培養(yǎng)箱：恒溫5%、10%CO2維持培養(yǎng)液中pH值。

倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細胞生長情況。

解剖顯微鏡：用于準確地取材。

常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養(yǎng)液，解剖液和鼠尾膠。

低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。

電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高壓消毒鍋：用于消毒培養(yǎng)皿，手術器械。

過濾器：配制解剖液、培養(yǎng)液，必須過濾后才可使用，以去除細菌。

滲透壓儀：pH劑，天平等。

三．培養(yǎng)器皿及手術器械

1.培養(yǎng)皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。

2.培養(yǎng)板：24-40孔，可用于開放培養(yǎng)。

3.培養(yǎng)瓶；

4.吸管：常用1，5，10mL，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。

5.各類培養(yǎng)液貯存器。

6.小型手術器械。

準備

一.配制培養(yǎng)液

（1）解剖液：以無機鹽（去除Ca2+, Mg2+ ）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。

（2）基礎培養(yǎng)基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。

（3）接種培養(yǎng)液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配制。

（4）維持培養(yǎng)液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營養(yǎng)物質(zhì)。

二.培養(yǎng)基質(zhì)

常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠。

三.消毒培養(yǎng)皿的備用

所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養(yǎng)前1天進行。

神經(jīng)細胞分散培養(yǎng)

（一）選材

常用胚胎動物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng)，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。

（二）取材

腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養(yǎng)。

（三）細胞分離與接種

神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數(shù)，預置細胞密度，接種于培養(yǎng)皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。

（四）抑制膠質(zhì)細胞生長

培養(yǎng)3-5d后，也有人認為培養(yǎng)7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長

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巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的 重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細 胞群，在條件適宜下可生活 2－3 周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。

巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如 P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難 以建株。

培養(yǎng)巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞， 以小鼠腹腔取材法最為實用， 其法如下：1、實驗前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯 lml（勿注入腸內(nèi)！，以 ） 刺流產(chǎn)生大量的巨噬細胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入 70%乙醇中 3－5 秒。

4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁， 把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。

5、用 70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸 10ml Eagle 液注入腹腔中，同時用手指從 兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動。

6、 用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側． 使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。

7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。

8、4℃下 250g 離心 10 分鐘后，去上清，加 10ml Eagle 培養(yǎng)基。

9、計數(shù)細胞。每只鼠可產(chǎn)生 20 一 30×106 細胞，其中 90%為巨噬細胞。

10、以 3×105 個貼附細胞/平方厘米接種。

11、接種數(shù)小時后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細胞，純化培養(yǎng)細胞，用 Eagle 液沖洗 1 一 2 次，再加新 Eagle 培養(yǎng)液置 CO2 溫箱中。

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