細(xì)胞名稱：狗腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞

MDCK

細(xì)胞培養(yǎng)條件：MEM+10%FBS+1%P/S  

生長(zhǎng)狀態(tài)：貼壁生長(zhǎng)

細(xì)胞是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要材料，也是生物細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，藥物、基因功能、疾病機(jī)理等的相關(guān)研究多數(shù)需要在細(xì)胞水平進(jìn)行闡釋。而細(xì)胞培養(yǎng)，受人員操作和環(huán)境條件的影響比較大，在細(xì)胞培養(yǎng)中常常會(huì)遇到很多的細(xì)節(jié)問(wèn)題，而每個(gè)問(wèn)題都有可能導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的失敗。我們匯總了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)分享給大家，希望能給大家的細(xì)胞培養(yǎng)帶來(lái)幫助。

一．細(xì)胞系身份需明確

我們之所以選定某種細(xì)胞系開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，是因?yàn)樗x細(xì)胞系的一些特性符合研究方向的設(shè)定。比如組織特性，疾病特性，功能特性，基因表達(dá)特性等。一旦用錯(cuò)了細(xì)胞株，對(duì)我們研究結(jié)果的判斷就會(huì)帶來(lái)很大的誤差和不確定性。

而近年來(lái)，多個(gè)機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系在培養(yǎng)和流通過(guò)程中，出現(xiàn)了很嚴(yán)重的交叉污染。據(jù)不*統(tǒng)計(jì)，單就HeLa細(xì)胞系導(dǎo)致的污染致使3萬(wàn)多篇論文結(jié)果的準(zhǔn)確性存在問(wèn)題（doi:10.1371/journal.pone.0186281）。而這種情況不僅僅限于HeLa細(xì)胞。多個(gè)機(jī)構(gòu)研究人員檢測(cè)發(fā)現(xiàn)超過(guò)451個(gè)細(xì)胞系已被其它細(xì)胞*吸收，在所檢測(cè)細(xì)胞中污染占比46%，可見(jiàn)細(xì)胞交叉污染的現(xiàn)象非常普遍。因此，做實(shí)驗(yàn)前對(duì)細(xì)胞株驗(yàn)明正身非常重要。如果是在機(jī)構(gòu)購(gòu)買的細(xì)胞株，最好能讓供方提供合格的STR鑒定報(bào)告。

目前，STR基因分型方法是進(jìn)行細(xì)胞交叉污染和性質(zhì)鑒定的*和準(zhǔn)確的方法之一，是ATCC等機(jī)構(gòu)認(rèn)定的金標(biāo)準(zhǔn)。不過(guò)可惜的是并非所有細(xì)胞均可進(jìn)行STR鑒定，目前只有大部分的人源細(xì)胞株和45個(gè)種類的小鼠細(xì)胞株可以進(jìn)行鑒定。其他細(xì)胞株可以結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、特性和物種鑒定來(lái)進(jìn)行確認(rèn)。

二．培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇

1.準(zhǔn)備工作：

根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特性，提前準(zhǔn)備好適合的培養(yǎng)基和血清等。最好沿用細(xì)胞原來(lái)的培養(yǎng)條件，以免細(xì)胞在新環(huán)境下還需要過(guò)渡適應(yīng)。同時(shí)，充分了解到細(xì)胞的生長(zhǎng)特性和形態(tài)特征，便于后續(xù)的培養(yǎng)觀察。

2.貼壁細(xì)胞傳代：

1）移棄使用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)液。（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導(dǎo)致易污染）

2）使用不含鈣鎂離子的PBS沖洗細(xì)胞。從與貼壁細(xì)胞層相對(duì)的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動(dòng)細(xì)胞層，前后搖晃容器數(shù)次，最后移棄沖洗液。（洗去殘留的血清，避免影響活性。）

3）以 25 cm2的培養(yǎng)瓶為例，向瓶?jī)?nèi)加入1ml胰蛋白mei-EDTA（請(qǐng)根據(jù)各細(xì)胞的指引使用合適的濃度）消化液，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，幾分鐘內(nèi)，會(huì)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，傾斜培養(yǎng)瓶時(shí)細(xì)胞層能自然流下，此時(shí)應(yīng)加入2-3ml含血清的*培養(yǎng)液終止消化（細(xì)胞解離所需時(shí)間請(qǐng)參考各細(xì)胞的指引，并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細(xì)胞的解離情況）。另外，并不是所有貼壁細(xì)胞都適用采用胰蛋白mei進(jìn)行解離，請(qǐng)根據(jù)各細(xì)胞的指引選擇合適的解離方法。

4）使培養(yǎng)瓶?jī)A斜，吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體輕輕沖向原細(xì)胞生長(zhǎng)表面，重復(fù)該動(dòng)作2-3次，使所有細(xì)胞沿瓶底流下，再輕柔地把細(xì)胞吹打成單個(gè)懸液（吹打過(guò)程中應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生）。

PS：對(duì)于難消化的細(xì)胞，盡量不要通過(guò)用力吹打的方式來(lái)處理，以免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生物理?yè)p傷?？梢韵葘⒁呀?jīng)消化的細(xì)胞分出來(lái)，及時(shí)終止消化。然后再對(duì)仍然貼壁的細(xì)胞進(jìn)行再次消化。做到分層消化，避免易消化細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間在消化下受損。

5）把所有的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。

6）加入新的含血清*培養(yǎng)液重懸成單細(xì)胞懸液。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例，把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補(bǔ)足新的含血清*培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁情況。

3.懸浮細(xì)胞傳代：

因懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞不貼壁，故傳代時(shí)不必采用酶消化方法，而可直接傳代或離心收集細(xì)胞后傳代。

1）直接傳代時(shí)，靜置5-10分鐘，待懸浮細(xì)胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培養(yǎng)液，補(bǔ)足新鮮的含血清*培養(yǎng)液，混勻成細(xì)胞懸液。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例，把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，輕輕搖晃混勻。

2）離心傳代時(shí)，將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清后，加入新鮮的含血清*培養(yǎng)液重懸。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例，把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補(bǔ)足新鮮的含血清*培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻。

3）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況。

4.貼壁懸浮混合型細(xì)胞傳代：

先將懸浮的細(xì)胞收集，再參考“貼壁細(xì)胞傳代"方法進(jìn)行消化收集，一起接種到培養(yǎng)器皿中。

PS: 懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)中一般對(duì)細(xì)胞密度要求比較高，培養(yǎng)中最好參考指南控制好細(xì)胞密度，不能過(guò)密也不能過(guò)稀。

5.細(xì)胞凍存：

1）按照“細(xì)胞傳代步驟"中的方法收集細(xì)胞。

2）加入細(xì)胞凍存液（一般10%DMSO+對(duì)應(yīng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液），使細(xì)胞的終密度為(5~10)×105個(gè)/ml，移入細(xì)胞凍存管中。

3）程序降溫（以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例）：4℃ 30min→-80℃過(guò)夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否則凍存液無(wú)法滲透到細(xì)胞，易產(chǎn)生冰晶導(dǎo)致細(xì)胞受損。）

6.細(xì)胞復(fù)蘇：

1）取出貯存的細(xì)胞，待液氮揮發(fā)后，馬上37℃水浴中輕輕搖動(dòng)使快速融化（通常2min內(nèi)，時(shí)間長(zhǎng)了細(xì)胞狀態(tài)會(huì)受影響）。為避免劇烈的溫差變化導(dǎo)致凍存管炸裂，操作該步時(shí)請(qǐng)配戴防護(hù)面罩或防護(hù)目鏡。

PS：干冰運(yùn)輸?shù)膬龃婕?xì)胞，收到后需要立刻放入深低溫冰箱或液氮中，至少3d后再進(jìn)行復(fù)蘇操作。

2）轉(zhuǎn)移到無(wú)菌操作臺(tái)，75%酒精擦拭凍存管外部。

3）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有10-20ml經(jīng)預(yù)熱的含血清*培養(yǎng)液離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清。

4）重新加入經(jīng)預(yù)熱的含血清*培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以約(3~5)×105個(gè)/ml密度接種到培養(yǎng)器皿中。

5）放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況。

狗腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞

三.污染防治

1.細(xì)菌污染

細(xì)菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的污染，主要由操作不慎或使用了滅菌不*的耗材與試劑引入。最常見(jiàn)的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌及白色葡萄球菌。鏡下形態(tài)則為長(zhǎng)桿狀、短桿狀和顆粒狀等。

好氧菌增殖分裂迅速，感染24h內(nèi)即可使培養(yǎng)基渾濁；厭氧菌在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下增殖緩慢，需要較長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)觀察到渾濁現(xiàn)象。

污染處理：由于國(guó)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)中抗生素使用泛濫，所以出現(xiàn)污染后加雙抗（Penicillin + Streptomycin）一般沒(méi)有效果。桿菌可選用100ug/ml慶大霉su處理一周，顆粒狀細(xì)菌可用25ug/ml環(huán)丙沙xing處理一周，效果相對(duì)還不錯(cuò)。

2. 真菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的污染真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。

左邊這張是比較典型的霉菌污染的圖片，右圖是酵母污染，鏡下可以看到明顯的出芽形態(tài)。

污染處理：可用100ug兩性霉素/T25瓶，處理一周。

注：性較大，需要在細(xì)胞有50%以上且狀態(tài)沒(méi)受大影響前處理。

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