細(xì)胞名稱：人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞（STR鑒定）

細(xì)胞代碼： MCF-7/Adr 

培養(yǎng)條件： 1640+10%FBS+0.01mg/mL胰島素+1%PS+500ng/mL ADR

生長狀態(tài)：貼壁生長

耐藥細(xì)胞構(gòu)建方法

目前已知的體外建立耐藥細(xì)胞株的方法主要有以下幾種：大劑量藥物沖擊法、藥物濃度遞增法、藥物濃度遞增與大劑量藥物沖擊相結(jié)合法、轉(zhuǎn)基因結(jié)合藥物篩選法。其中藥物濃度遞增法和大劑量藥物沖擊法成為臨床建立腫瘤細(xì)胞耐藥模型的常用方法。

①藥物濃度遞增法是指最初使用低濃度的藥物刺激細(xì)胞，等待細(xì)胞適應(yīng)低濃度的環(huán)境之后，再略微提高藥物濃度，繼續(xù)等待細(xì)胞適應(yīng)目前的環(huán)境，經(jīng)過反復(fù)的培養(yǎng)和加壓，最終使細(xì)胞可以在高濃度的藥物環(huán)境下生存。

②大劑量藥物沖擊法是在細(xì)胞培養(yǎng)時加入超高藥物濃度的藥物，但是孵育的時間很短，一般僅有幾分鐘，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至不含藥物的培養(yǎng)液中慢慢恢復(fù)，通過重復(fù)以上步驟最終篩選出高倍數(shù)的耐藥細(xì)胞株。

這兩種方法各有優(yōu)缺點：藥物濃度遞增法的優(yōu)點在于誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的藥物劑量循序漸進(jìn)，細(xì)胞培養(yǎng)的外環(huán)境逐漸改變，細(xì)胞較易耐受, 狀態(tài)較好, 缺點在于誘導(dǎo)耐藥過程耗時很長，且其化藥物的作用方式與臨床上療藥物大劑量短療程的療原則存在一定的差異；大劑量藥物沖擊法的誘導(dǎo)的優(yōu)點是與臨床上大劑量藥物沖擊的治療方式相接近，但是缺點在于大劑量藥物沖擊法的藥物濃度很高，細(xì)胞培養(yǎng)由于外環(huán)境驟變，細(xì)胞可能難以耐受，細(xì)胞狀態(tài)較難控制，且耐藥性能不穩(wěn)定。

建立模型的評價方法

建立模型的評價方法主要有以下兩種：耐藥倍數(shù)的檢測；耐藥相關(guān)蛋白的檢測。①通過MTT、CellTiter-Glo發(fā)光法（CTG）測定藥物對親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的IC50，計算耐藥指數(shù)。耐藥指數(shù)（Resistance index，RI）=耐藥細(xì)胞系IC50/親本細(xì)胞系IC50。②WB、PCR、流式、免疫學(xué)等多項方法檢測耐藥相關(guān)蛋白（P-糖蛋白、多藥耐藥蛋白1）的表達(dá)情況。

人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞（STR鑒定）

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人原代軟骨細(xì)胞永生化

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人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 sh-sy5y轉(zhuǎn)染突變型

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 sh-sy5y轉(zhuǎn)染野生型

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小鼠脂肪干細(xì)胞永生化

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小鼠骨髓巨噬細(xì)胞永生化

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小鼠肝星狀細(xì)胞永生化

大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞永生化

大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞永生化

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37.如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞？能用蛋白酶消化嗎？

我們推薦使用脫落細(xì)胞的方法，此技術(shù)破壞性最小，生活力最高。通過使用巴斯德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰消化細(xì)胞。

38.胰消化一個T25瓶的sf9細(xì)胞：

1. 去除培養(yǎng)基。

2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS。

3. 加入2ml 1x胰EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。

4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。

5. 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰的活性。）

6. 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。

7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。

39.在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。

40.在重新凍存sf9細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎？

通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無論什么時候計數(shù)時，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。

41.貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，在放置幾天后顏色變紫?

這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。

42. 細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？

如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

43. 無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？

當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。

44. 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

45.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎？

大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

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