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原代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

錯(cuò)誤1：

一小管原代細(xì)胞在水浴中解凍一段時(shí)間。

糾正1：

原代細(xì)胞對(duì)解凍過(guò)程非常敏感，因此將小瓶置于37℃水浴中，保持并輕輕旋轉(zhuǎn)直到內(nèi)容物剛剛解凍是很重要的。然后應(yīng)立即從水浴中取出小瓶，并轉(zhuǎn)移到無(wú)菌操作臺(tái)。確保您的培養(yǎng)瓶在解凍前已經(jīng)準(zhǔn)備就緒，以便可以立即用于接種細(xì)胞，并置于培養(yǎng)箱中。

錯(cuò)誤2：

解凍match小瓶后直接離心原代細(xì)胞。

糾正2：

我們不建議在解凍后離心細(xì)胞，因?yàn)殡x心程序比少量的DMSO殘留更有害。記住，在恢復(fù)原代細(xì)胞后的第二天更換培養(yǎng)基以去除任何殘留的DMSO。

錯(cuò)誤3：

允許原代細(xì)胞變得過(guò)于融合。

糾正3：

當(dāng)生長(zhǎng)至100％匯合時(shí)，原代細(xì)胞可以變得衰老。記住，原代細(xì)胞不是100％純，因此重要的是盡量減少污染細(xì)胞的生長(zhǎng)。我們建議在細(xì)胞達(dá)到90-95％融合時(shí)，對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

錯(cuò)誤4：

傳代原代細(xì)胞時(shí)過(guò)度胰蛋白酶消化。

糾正4：

當(dāng)細(xì)胞傳代時(shí)，使用低濃度的胰蛋白酶并在顯微鏡下密切監(jiān)測(cè)細(xì)胞。此外，記得在胰蛋白酶消化后中和細(xì)胞中的胰酶，因?yàn)槿魏位钚缘囊鹊鞍酌付紝p傷細(xì)胞。

錯(cuò)誤5：

原代細(xì)胞可以很容易地重新凍存。

糾正5：

通常我們不推薦重新凍存原代細(xì)胞，因?yàn)檫@可以促進(jìn)細(xì)胞衰老和/或?qū)е鹿δ茏兓?。原代?xì)胞非常敏感，重新凍結(jié)可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡或損傷。

錯(cuò)誤6：

原代細(xì)胞可以無(wú)限的增殖。

糾正6：

與細(xì)胞系不同，原代細(xì)胞具有有限的擴(kuò)增能力。我們建議盡早使用原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以防止遺傳漂移。此外，如果你正在使用一個(gè)增值困難的細(xì)胞類型，你應(yīng)該密切監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)，因?yàn)樯倭炕祀s的細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）可能隨著時(shí)間的推移，大量生長(zhǎng)從而成為主要細(xì)胞。

錯(cuò)誤糾正后就該步入正軌啦——

應(yīng)如何進(jìn)行凍存細(xì)胞的培養(yǎng)？

下列步驟以單管凍存細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方案為例。

● 準(zhǔn)備一燒杯37°C的水。

● 從液氮儲(chǔ)存中取出一管細(xì)胞，注意保護(hù)手和眼睛。

● 擰松管蓋1/4圈，等待10秒鐘以釋放螺紋中可能殘留的液氮，再重新擰緊管蓋。

● 將凍存管的下半部分置于37°C水浴中進(jìn)行解凍，直至凍存管內(nèi)僅剩余一小塊冰芯，使細(xì)胞迅速解凍。

● 用消毒液擦拭管體外表面，再將其移至II級(jí)A型層流細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥中。

● 打開管蓋，使用1 mL移液器上下吹打細(xì)胞懸液以分散細(xì)胞。

                                                          臺(tái)盼藍(lán)染色

● 從管中吸取20 uL細(xì)胞懸液，并將其稀釋于20 uL臺(tái)盼藍(lán)溶液中。

● 使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板來(lái)確定每毫升懸液中的活細(xì)胞數(shù)。

● 將管中懸液（1 mL）稀釋至產(chǎn)品說(shuō)明中的推薦濃度。

● 將5 mL細(xì)胞懸液加入25 cm2培養(yǎng)瓶，或?qū)?5 mL細(xì)胞懸浮液加入75cm2培養(yǎng)瓶中。

● 搖勻培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基以分散細(xì)胞。許多類型的細(xì)胞都會(huì)迅速貼壁，如果沒有在傳代后即刻搖勻細(xì)胞，細(xì)胞可能生長(zhǎng)不均勻。

● 在37°C、5% CO2/95%空氣、濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。為了獲得最佳結(jié)果，培養(yǎng)開始后至少在24小時(shí)之內(nèi)不要擾動(dòng)細(xì)胞。

是否可以對(duì)擴(kuò)增后的細(xì)胞重新凍存？如果可以該如何操作？

當(dāng)從細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買的凍存或正處于增殖期的細(xì)胞，可對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增和重新凍存。不過(guò)，凍存操作可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)有所影響。下列實(shí)驗(yàn)方案為大家提供了一份使用無(wú)蛋白成份的凍存培養(yǎng)基凍存細(xì)胞的基礎(chǔ)指南。

請(qǐng)注意：由于凍存設(shè)備與個(gè)人技術(shù)之間的差異，我們無(wú)法確保使用本方案凍存的細(xì)胞在復(fù)蘇后能夠保持活力，我們也無(wú)法為研究用戶實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞的效果進(jìn)行擔(dān)保。

● 使用37°C水浴化凍無(wú)蛋白成份的凍存培養(yǎng)基或4°C條件下過(guò)夜化凍。

● 如果在水浴中進(jìn)行化凍，請(qǐng)確保溫度不要超過(guò)37°C，也勿將該產(chǎn)品延長(zhǎng)時(shí)間置于37°C。

● 無(wú)蛋白成份的凍存培養(yǎng)基在使用前應(yīng)置于4°C條件下平衡。為獲得優(yōu)結(jié)果，推薦大家使用能夠控制變溫速率的冰箱。如果缺少能夠控制變溫速率的冰箱，也可使用細(xì)胞凍存盒。

● 如需用酶試劑解離培養(yǎng)器皿表面的細(xì)胞，則需使用對(duì)應(yīng)的終止溶液重懸細(xì)胞以中和酶的效果。

● 通過(guò)離心沉淀細(xì)胞。

● 去除上清液后，使用預(yù)冷的無(wú)蛋白成份的凍存培養(yǎng)基以5x10E5至3x10E6細(xì)胞/毫升的密度重懸細(xì)胞。

● 將細(xì)胞懸液分裝至合適數(shù)量的凍存管中。

● 將細(xì)胞盡快冷卻至4°C。

● 如果使用控制變溫速率的冰箱：以每分鐘降低1°C的速率冰凍樣品，直至–40°C。之后按照每分鐘降低2°C的速率降至–90°C左右。

● 如果使用細(xì)胞凍存盒：請(qǐng)按照說(shuō)明書來(lái)準(zhǔn)備凍存盒。

● 為獲得最佳結(jié)果，推薦大家在細(xì)胞溫度降至–80°C后，盡快將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮儲(chǔ)存設(shè)備的氣相中。

● 作為無(wú)蛋白成份的凍存培養(yǎng)基的替代品，可使用該凍存細(xì)胞推薦的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清（FBS）和10% DMSO進(jìn)行細(xì)胞凍存。 

組織塊貼壁法分離細(xì)胞時(shí)：注意組織塊貼壁2-3h后，補(bǔ)液時(shí)沿壁輕輕加入培養(yǎng)基，防止組織塊漂浮。

特別提醒：

如果用血清培養(yǎng)原代細(xì)胞，那么需要用到更高級(jí)別的胎牛血清，特級(jí)胎牛血清，

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